Metode Praktis memurnikan Metarhizium anisopliae dari larva Oryctes rhinoceros terinfeksi

Salah satu sifat dari jamur Metarhizium anisopliae adalah munculnya variabilitas dan menurunnya vurulensi jamur tersebut ketika disimpan dalam medium sintetis.  Usaha-usaha yang dapat dilakukan untuk menjaga Virulensi jamur Metarhizium anisopliae terhadap larva Oryctes rhinoceros agar tetap tinggi adalah dengan menginfeksikan kembali (reinfection) jamur tersebut pada inang aslinya yaitu larva Oryctes rhinocerosReinfection dapat digunakan untuk mengetahui virulensi Metarhizium anisopliae pada larva Oryctes rhinoceros setelah dibiakkan dan disimpan dalam medium sintetis (PDA) dalam jangka waktu tertentu.  Karena pada masa perbanyakan dan penyimpanan dengan menggunakan medium sintetis, jamur Metarhizium anisopliae mengalami penurunan virulensi.  Hal tersebut disebabkan karena beberapa faktor eksternal yang mempengaruhi saat masa perbanyakan dan penyimpanan.  Faktor-faktor tersebun antara lain ph media, kandungan nutrisi pada media, fluktuasi suhu pada saat penyimpanan dan lain sebagainya.

Hal-hal yang harus diperhatikan dalam memurnikan jamur Metarhizium anisopliae.

  1. 1. Penentuan waktu reinfection

Kapan saat yang tepat untuk melakukan reinfection adalah pertanyaan dasar yang harus mampu dijawab oleh siapa saja yang bertanggungjawab menjaga virulensi jamur Metarhizium anisopliae. Idealnya reinfection dilakukan setiap 6 (enam) bulan sekali.  Semakin lama disimpan dalam medium sintetis maka semakin turun virulensinya.

  1. 2. Penyediaan larva Oryctes rhinoceros sehat

Larva Oryctes rhinoceros sehat tersedia merupakan syarat utama yang harus dipenuhi setiap akan melakukan kegiatan pemurnian jamur Metarhizium anisopliae. Larva Oryctes rhinoceros sebagai inang dari jamur Metarhizium anisopliae adalah alat ukur dari virulensi jamur Metarhizium anisopliae. Keberhasilan jamur Metarhizium anisopliae meninfeksi larva Oryctes rhinoceros dalam jangka waktu tertentu (1-2 minggu) adalah indikator bahwa jamur Metarhizium anisopliae tetap virulen terhadap inangnya yaitu larva Oryctes rhinoceros.

Penyediaan larva Oryctes rhinoceros sehat dapat dilakukan dengan cara rearing larva Oryctes rhinoceros di laboratorium dan dengan eksplorasi larva Oryctes rhinoceros dari lapang.  Kendala penyediaan larva Oryctes rhinoceros dari eksplorasi lapang adalah larva Oryctes rhinoceros tidak dapat diperoleh sewaktu-waktu dan  keseragaman instar yang diperoleh rendah.  Larva Oryctes rhinoceros banyak ditemukan di tumpukan ampas tebu, jerami, kotoran ternak dan tunggul-tunggul kelapa yang telah lapuk pada saat awal musim penghujan dan atau ahir musim kemarau.

Reinfection

Menginfeksikan kembali jamur Metarhizium anisopliae pada inang aslinya adalah salah satu cara untuk mengetahui kejituan jamur Metarhizium anisopliae dalam mengendalikan populasi Oryctes rhinoceros. Berikut disampaikan langkah-langkah reinfection jamur Metarhizium anisopliae terhadap larva Oryctes rhinoceros.

Alat dan bahan

Alat:

  1. Autoclave
  2. Topeles plastik
  3. sarung tangan
  4. cetok
  5. Bak plastik

Bahan:

  1. Pakan alami larva Oryctes rhinoceros (ampas tebu, dan jerami)
  2. Larva Oryctes rhinoceros sehat.
  3. Jamur Metarhizium anisopliae (ditumbuhkan pada media jagung giling)

Langkah-langkah reinfection

  1. Kumpulkan larva Oryctes rhinoceros pada bak plastik.
  2. Sterilkan pakan alami larva Oryctes rhinoceros menggunakan Autoclave dengan suhu 121 derajat celcius dan tekanan 1 atm selama 20 menit.
  3. Setelah disteril, masukkan pakan alami larva Oryctes rhinoceros kedalam topeles plastik dan biarkan hingga dingin.
  4. Masukkan jamur Metarhizium anisopliae sebanyak 2 (dua) sendok makan ke dalam pakan alami Larva Oryctes rhinoceros lalu aduk rata.
  5. Masukkan Larva Oryctes rhinoceros kedalam topeles yang telah berisi pakan alaminya yang telah dicampur dengan jamur Metarhizium anisopliae
  6. Inkubasikan selama 14 (empat belas) hari
  7. Amati mortalitas larva Oryctes rhinoceros
  8. Ambil larva-larva Oryctes rhinoceros yang telah mati akibat jamur Metarhizium anisopliae
  9. Murnikan jamur Metarhizium anisopliae yang menginfeksi larva Oryctes

Beberapa ciri-ciri Larva Oryctes rhinoceros yang telah mati dan terinfeksi jamur Metarhizium anisopliae adalah sebagai berikut

  1. Tubuh mati dengan kondisi kaku kering, tidak lembek dan tidak berbau busuk.
  2. Pada awal kematiannya tubuh berwana putih kekuningan, dan timbul beberapa bercak cokelat kehitaman.
  3. Pada fase selanjutnya tubuh akan mengalami mumifikasi
  4. Pada tahap lanjut tubuh akan diselimuti jamur berwarna hijau (Metarhizium anisopliae)

Setelah kegiatan reinfection berhasil dilakukan maka langkah selanjutnya adalah mengisolasi jamur Metarhizium anisopliae dari tubuh larva Oryctes rhinoceros.  Kegiatan isolasi ini sekaligus untuk membuktikan bahwa penyebab kematian larva Oryctes rhinoceros adalah jamur Metarhizium anisopliae.


Isolasi

Isolasi adalah memisahkan jamur Metrhizium anisopliae dari tubuh larva Oryctes rhinoceros dengan cara menumbuhkan jamur Metrhizium anisopliae pada media sintetis agar diperoleh jamur Metarhizium dalam kultur media sintetis (isolat).  Media umum yang dapat digunakan untuk isolasi jamur Metarhizium anisopliae dari tubuh larva Oryctes rhinoceros adalah Potato Dekstrose Agar (PDA).

Berikut disampaikan langkah-langkah isolasi jamur Metrhizium anisopliae dari tubuh larva Orycvtes rhinoceros.

Alat dan bahan:

Alat:

  1. Laminar Air Flow (INCASE)
  2. Lampu Bunsen
  3. Jarum ent / inoculation set (steril)
  4. Petridish (steril)
  5. Disecting set (steril)
  6. Sprayer
  7. Korek api

Bahan:

  1. Larva Oryctes rhinoceros terinfeksi
  2. PDA dalam petridish
  3. Alkohol 70 %
  4. Alkohol 96%
  5. Aquadest steril
  6. kertas tissue
  7. Plastik

Langkah – langkah isolasi

  1. Sterilisasi laminar air flow (incase).  Sterilisasi dilakukan dengan menyemprotkan alkohol 96% dan penyinaran lampu ultraviolet selama 30 (tiga puluh) menit pada bagian dalam incase.
  2. Tuangkan aquadest seteril kedalam petridish sebanyak 3 (tiga) kali ulangan.
  3. Tuangkan alkohol 70 % kedalam petridish sebanyak 1 (satu) kali ulangan.
  4. Menyalakan lampu bunsen.
  5. Masukkan Larva Oryctes rhinoceros terinfeksi diatas petridish, aquadest steril, alkohol, lampu bunsen, desecting set dan inoculation set kedalam incase.
  6. Potong tubuh larva Oryctes rhinoceros pada bagian kepala sampai sepasang tungkai depan dengan menggunakan pisau disecting.
  7. Ambil sebagian daging larva (bukan kulitnya) dengan menggunakan jarum ent
  8. Masukkan kedalam alkohol 70 % selama 10-30 detik lalu bilas dengan aquadest steril sebanyak 3 (tiga) kali secara bertingkat.
  9. Letakkan diatas kertas tissue steril selama 5-10 detik
  10. Inokulasikan daging larva ke media PDA dengan menggunakan jarum ent
  11. Inkubasikan selama 2-5 hari.
  12. Jika jamur Metarhizium anisopliae telah berkecambah, tumbuh hifa dan mulai membentuk koloni maka jamur Metarhizium anisopliae siap dimurnikan.

Pemurnian

Pemurnian adalah memurniakan jamur Metarhizium anisopliae dari mikroorganisme lain (jamur dan bakteri) yang ikut tumbuh selama proses isolasi.  Hasil dari pemurnian adalah isolat murni jamur Metarhizium anisopliae.  Ada beberapa teknik dalam memurniakan jamur Meterhizium anisopliae yaitu teknik isolasi monospora dan teknik Pemanggilan hifa. Teknik isolasi monospora adalah salah satu teknik pemurnian yang dilakukan dengan cara mengisolasi spora tunggal atau mengambil spora tunggal untuk dipindahkan (diinokulasi) pada medium yang baru.  Teknik isolasi monospora ini membutuhkan keterampilan tinggi dalam melaksanakannya, karena dibutuhkan kejelian dalam memindahkan spora tunggal pada medium yang baru.  Sedangkan teknik pengambilan hifa adalah teknik pemurnian yang dilakukan dengan cara mengambil sebagian kumpulan hifa jamur Metarhizium anisopliae untuk dipindahkan pada medium yang baru.  Teknih pengambilan hifa ini relatif lebih mudah dibandingkan dengan isolasi monospora.

  1. Teknik isolasi Monospora.

Teknik isolasi monospora adalah salah satu teknik dalam memurnikan jamur Metarhizium anisopliae. Teknik pengambilan spora tunggal kemudian dipindahkan pada medium yang baru ini adalah teknik yang paling ideal.  Dianggap paling ideal karena teknik tersebut memiliki tingkat keakurasian yang sangat tinggi.  Satu sel spora yang dibiakkan dalam medium akan berkecambah kemudian tumbuh membentuk hifa kemudian hifa tersebut tumbuh bercabang-cabang membentuk miselium.  Pertumbuhan selanjutnya miselium-miselium yang telah menebal kemudian membentuk spora.  Sehingga isolat-isolat yang dihasilkan dengan menggunakan teknik isolasi monospora ini diyakini kemurniannya.

Teknik isolasi monospora ini juga dapat digunakan untuk mengidentifikasi spora-spora yang diisolasi, apakah spora tersebut akan menghasilkan isolat kuat ataukah lemah.  Dengan teknik ini pula kita dapat mengkoleksi isolat kuat dan isolat lemah dan dapat digunakan sesuai dengan kebutuhan.

Langkah-langkah Pemurnian Metarhizium anisopliae dengan menggunakan Teknik Isolasi Monospora :

Alat dan bahan:

Alat:

  1. Laminar Air Flow (INCASE)
  2. Mikroskop serangga
  3. Lampu Bunsen
  4. Jarum ose (steril)
  5. Disecting set (steril)
  6. Korek api

Bahan:

  1. Hasil Isolasi Jamur Metarhizium anisopliae dari larva Oryctes rhinoceros terinfeksi
  2. Alkohol 96%
  3. Medium PDA

Langkah-langkah pemurnian:

  1. Ambil spora jamur Metarhizium anisopliae yang telah tumbuh dari hasil isolasi dengan menggunakan jamrum ose
  2. Lakukan streak spora pada medium PDA
  3. Inkubasikan selama 16 jam
  4. Amati dengan menggunakan Mikroskop serangga
  5. Ambil satu spora yang telah tumbuh dengan menggunakan jarum serangga atau jarum pentul.
  6. Pindahkan pada medium PDA
  7. Inkubasikan selama 14 hari
  8. Jamur Metarhizium anisopliae siap diperbanyak dalam bentuk isolat murni

2 Teknik Pengambilan Hifa

Teknik pemurnian Metarhizium anisopliae dengan menggunakan teknik pengambilan hifa ini relatif lebih mudah dibandingkan dengan Teknik Isolasi Monospora.  Teknik pengambilan hifa dilakukan dengan cara mengambil sebagian hifa jamur Metrahizium anisopliae yang telah tumbuh setelah isolasi dari tubuh Oryctes rhinoceros terinfeksi.  5 (lima) hari setelah isolasi,  hifa yang tumbuh dari daging Oryctes rhinoceros diambil dengan menggunakan jarum ose untuk dipindahkan pada medium PDA.

Alat dan bahan:

Alat:

  1. Laminar Air Flow (INCASE)
  2. Lampu Bunsen
  3. Jarum ent (steril)
  4. Disecting set (steril)
  5. Korek api

Bahan:

  1. Hasil Isolasi Jamur Metarhizium anisopliae dari larva Oryctes rhinoceros terinfeksi
  2. Alkohol 96%
  3. Medium PDA

Langkah-langkah pemurnian:

  1. Ambil spora hifa atau miselium Metarhizium anisopliae yang telah tumbuh dari hasil isolasi dengan menggunakan jarum ent
  2. Inokulasikan pada medium PDA
  3. Inkubasikan selama 5-10 hari
  4. Amati pertumbuhan jamur
  5. Jamur Metarhizium anisopliae siap diperbanyak dalam bentuk isolat murni

Lampiran 1.

lampiran 2.

Lampiran 3.

LAmpiran 4.

One response to “Metode Praktis memurnikan Metarhizium anisopliae dari larva Oryctes rhinoceros terinfeksi

  1. trimsssssssssss bozzzzzzzzzz

Tinggalkan Balasan

Isikan data di bawah atau klik salah satu ikon untuk log in:

Logo WordPress.com

You are commenting using your WordPress.com account. Logout / Ubah )

Gambar Twitter

You are commenting using your Twitter account. Logout / Ubah )

Foto Facebook

You are commenting using your Facebook account. Logout / Ubah )

Foto Google+

You are commenting using your Google+ account. Logout / Ubah )

Connecting to %s